Promotie R.J.A. (Ruben) Schep

Samenvatting:

Dit proefschrift had als doel de invloed van chromatine op de balans van DNA-herstelpaden en de efficiëntie van CRISPR-Cas9-bewerkingen te onderzoeken. Hiervoor werd een reportersequentie gebruikt, bestaande uit een doelsequentie voor het vormen van dubbelstrengsbreuken (DSB's) met CRISPR-Cas9 en een unieke barcode. Deze reportersequenties werden willekeurig in het genoom van menselijke cellen ingevoegd en elke reporter werd in kaart gebracht naar zijn overeenkomstige genomische coördinaat. Door publiekelijk beschikbare chromatinegegevens te integreren, hebben we verbanden gelegd tussen de chromatineomgeving en de reporters. Door de vorming van DSB's konden we zowel de totale mutaties als de mutaties die specifiek zijn voor non-homologous end joining (NHEJ) en microhomology mediated end joining (MMEJ), de twee belangrijkste DSB-herstelmechanismen, kwantificeren. Analyse van de gegevens in de context van chromatine toonde een verschuiving naar MMEJ aan in heterochromatine, een inactieve vorm van chromatine. Verder bevestigden we eerdere bevindingen door een vermindering van de totale mutatiefrequentie binnen heterochromatine aan te tonen. Daarnaast voerden we een uitgebreide screening van geneesmiddelen uit om de wisselwerking tussen geneesmiddelen en chromatine in de context van DNA-herstel en CRISPR-Cas9-bewerkingen te onderzoeken. Talrijke geneesmiddelen bleken gevoelig te zijn voor verschillende chromatine-toestanden, en we hebben enkele potentiële kandidaten geïdentificeerd die de Cas9-bewerkingen zouden kunnen verbeteren. Ten slotte onderzochten we de kinetiek van de twee belangrijkste herstelpaden en Cas9, waarbij we hebben ontdekt dat processen trager verlopen binnen heterochromatine.